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优质和牛超数排卵和胚胎移植效果的影响因素研究

发布时间:2019-05-05
  摘 要
  
  超数排卵和胚胎移植技术可最大程度地发挥母牛的繁殖潜力,实现快速扩繁,从而加速品种改良和育种进程,因此,研究超数排卵和胚胎移植技术对优质和牛繁殖效率的影响具有重要意义。本研究以和牛为试验对象,研究了影响优质和牛超数排卵和胚胎移植效果的因素,旨在为优质和牛体内胚胎生产和移植提供实践参考。
  
  试验一:选择 34 头青年和牛(16~22 月龄)和 37 头第一胎经产和牛作为供体,按 4 天8 次递减肌肉注射 FSH(Folltropin-V)进行超排处理,共超排 112 头次。试验结果表明:(1)供体母牛超排有效率为 85.7%,共获得 1145 枚胚胎(头均获胚胎 10.22 枚),其中可用胚832(头均获胚胎 7.43 枚));(2)经产牛超排有效率(93.4%)显着高于青年牛(76.0%)(P<0.05),胚胎数和可用胚也高于青年牛,但两组无显着差异(P>0.05);(3)青年牛和经产牛的第一次和第二次超排有效率差异均不显着(P>0.05),但青年牛第二次超排胚胎数(6.20)和可用胚胎数(4.31)低于第一次胚胎数(8.68)和可用胚胎数(6.53);而经产牛的第二次超排胚胎数(12.92)高于第一次胚胎数(11.41),可用胚胎数(8.38) 却稍低于第一次可用胚胎数(8.89);(4)不同剂量 FSH 可显着影响母牛超排效率, 总剂量 120mgFSH 组青年牛超排有效率(50%)显着低于 200mg 和 220mg 组(P<0.05)。经产牛 220mg组超排有效率(86.7%)显着低于 230mg、240mg 和 250mg 组,可用胚胎数(7.8)也低于其他组;(5)自然发情、前列腺素同期发情和埋植 CIDR 同期发情的超排有效率分别为 85.4%、85.7%和 88.9%,平均回收胚胎数分别为 12.0、10.0、和 12.3,可用胚胎数分别为 8.7、7.2、和 9.3,差异均不显着(P>0.05)。

优质和牛超数排卵和胚胎移植效果的影响因素研究
  
  试验二:试验分别在 2017 年和 2018 年移植受体母牛 321 头次和 192 头次。结果表明:(1)2017 年和 2018 年的胚胎移植妊娠率分别为 40.50%和 43.23%;(2)桑葚阶段和囊胚阶段胚胎移植妊娠率分别为 32.0%和 38.1%,两者差异不显着(P>0.05);(3)受体母牛移植2枚新鲜胚胎(B级胚胎)的妊娠率为75.00%,移植切割后新鲜双半胚的妊娠率为57.2%,移植 1 枚新鲜胚胎的妊娠率为 55.00 %,三者间差异不显着(P>0.05),但移植 2 枚新鲜胚胎(B 级胚胎)的效果最好;(4)前列腺素 1 次同期处理发情的母牛胚胎移植妊娠率最高,而 CIDR 同期发情处理的受体母牛胚胎移植妊娠率最低,但三者间差异不显着(P>0.05);(5)常规冷冻方法冷冻胚胎的移植妊娠率显着低于新鲜胚胎和玻璃化冷冻方法冷冻的胚胎移植妊娠率(P<0.05)。
  
  关键词:  和牛,超数排卵,胚胎,胚胎移植,外源生殖激素。
  
  Abstract
  
  As it plays more and more important roles in exploiting the potential fertility of female animal,the multiple ovulation and embryo transfer(MOET) is now used worldwidely to accelerate the breeding improvement and the number of first-class dairy and beef cattle. In order to provide some useful references for reproductive and administrative technicians in beef MOET, this study was carried out to study the influence factors involved in superovulation and embryo transfer in Wagyu cattle from years 2017 to 2018. The results were as follows: Experiment one: The influenc factors on the superovulation in Wagyu cattle Total 71 Wagyu were selected as the donors, which included 34 Wagyu heifers (16~20 months) and 37 Wagyu cows (first-calvin). Superovulation was performed by 8 times intramuscular injection of FSH (Follintropin-V) in 4 days as a conventional superovulation procedure. The results showed that:
  
  (1) 112 superovulations were totally carried out, and the efficiency of donor superovulation was 85.7%. 1145 embryos/ova were collectted, and total 832 transferable embryosobtained.
  
  (2) The superovulation efficiency of the cow donors (93.4%) was significantly higher than that of the heifers (76%)(P<0.05).
  
  (3) There was no significant difference in the first and second superovulation efficiency between heifers and cows. However, the number of embryos (6.20) and tranferableembryos (4.31) collected from second superovulation in heifer were lower than the number from first superovulation. Meanwhile, the number of embryos (12.92) collected from second superovulation in cows were higher than that from first superovulation (11.41), but the number of transferable embryos (8.38) was slightly lower than that from first transferable.
  
  (4) Different doses of FSH could significantly affect the superovulation efficiency of Wagyu cattles. The superovulation efficiency of 120mg group (50%) in heifer donoers was significantly lower than that of 200mg and 220mg group (P < 0.05). The superovulation efficiency (86.7%) in 220mg, 240mg and 250mg groups in cow donoers were significantly lower than that in other groups, and the number of available embryos (7.8) was also lower than that in other groups.
  
  (5) The superovulation efficiencies of spontaneous estrus donors, synchronizated estrus donoers by prostaglandin or synchronizated estrus donoers by CIDR were 85.4%,85.7% and 88.9%, respectively. The average number of embryos recovered from donoers were 12.0, 10.0 and 12.3, respectively, and there was no significant difference between these groups (P > 0.05).Meanwhile, the number of transferable embryos were 8.7, 7.2 and 9.3, respectively, and there also was no significant difference between groups (P > 0.05).
  
  Experiment two: The influence factors on embryo transfer of Wagyu cattle The embryos collected from Wagyu cattle donors were transferred to 321 Hestein heifer recipients in 2017, and 192 in 2018. The results showed that:
  
  (1) The pregnant rate of recipients checked by rectal palpation at 60d after embryo transfer was 40.50% in 2017, and 43.23% in 2018, respectively.
  
  (2) The pregnant rate of embryos at morula and blastocyst stage transferred to recipients were 32.0% and 38.1%, respectively, and there was no significant difference between them (P >0.05).
  
  (3) Checked by rectal palpation at 60d after embryo transfer, the pregnant rate of the recipients transferred two fresh whole embryos (grade B ) was 75.00%, and the pregnancyof the recipients transferred fresh two-half-embryos splitted was 57.2%, while the pregnant rate of the recipiens transferred one fresh whole embryos was 55.00%. There wasno significant difference among the three groups (P > 0.05).
  
  (4) Althouth the pregnant rate of recipients synchronizated by one prostaglandin treatment was highest, but there was no significant difference between the recipients synchronizated by CIDR and recipients in natural estrus.
  
  (5) The pregnant rate of recipients which received fembryos frozen by conventional freezing method (slow freezing method ) was significantly lower than that of transferred freshembryos or vitrified embryos (P < 0.05).
  
  Keywords:   Wagyu, superovulation,embryo, embryo transfer,exogenous reproductivehormone.
  
  第 1 章 文献综述
  
  家畜胚胎移植技术(embryo transfer,ET),尤其是牛胚胎移植技术经过几十年的研究日趋成熟并在生产中得到了广泛应用,成为家畜育种和快速扩繁的重要技术方法(Hasler,etal.,2006,2012)。目前,牛胚胎移植所需胚胎的重要来源是供体母牛超数排卵(简称超排)后,第七天非手术采集获得的可移植胚胎(张书汁 等,2017;高帅 等,2012;李强 等,2011)。
  
  虽然众多研究人员深入研究了牛超数排卵方法及其影响因素,并取得了较大进展(Reuben,etal.,2015;Gabriel,et al.,2011),但是牛胚胎移植成功近七十年来,供体牛每次超排获得的可用胚胎数几乎没有增加(Hasler,et al.,2006,2012),不同供体牛个体对相同的激素处理超排效果差异大,而且约有三分之一的供体母牛超数排卵反应较差(Looney,et al.,2012;Bo,et al.,2015;Hasler,et al., 2012),从而增加了牛体内胚胎生产成本,限制了牛胚胎移植技术在生产中的广泛应用(Hasler,et al.,2006)。
  
  1 卵泡发育与超数排卵1.1 发情周期卵泡发育初情期后,母牛具有了正常发情周期和繁殖能力(四川省畜牧科学研究院草食家畜研究所,2015)。在下丘脑-垂体-卵巢生殖轴激素的作用下,发情周期牛卵巢中卵泡和黄体这两种组织交替发育。首先,母牛卵巢生长卵泡池中的小有腔卵泡在促性腺激素(FSH)的作用下继续生长发育,其中 1~2 个卵泡发育形成优势卵泡,在促黄体生成素(LH)的作用下排卵;其次,排卵后的卵泡颗粒细胞和卵泡内膜细胞等形成黄体,黄体分泌孕酮;如果母牛未配种或者配种未妊娠,则在发情周期的一定时间(一般发情周期第 16 天左右),黄体在前列腺素(PG)的作用下开始退化溶解,新一轮卵泡发育开始,母牛进入下一个发情周期( Forde,etal.,2011;Quezadacasasola,et al., 2014 )(图 1-1 和图 1-2)。
  
 
  
  虽然牛是单胎家畜,发情时只有一个卵泡(极少数有 2 个卵泡)发育形成优势卵泡并排卵(Webb,et al.,2004;Rosalestorres,et al.,2012),然而实际上,绝大多数母牛(>95%)在 一 个 发 情 周 期 中 卵 巢 上 常 常 有 2 ~ 3 个 卵 泡 发 育 波 (Forde,et al.,2011; 张 运海,2000;Adams,1994; 1998),即卵巢上有多个(8~41 个)直径 3~4mm 的小卵泡同时开始发育(Adams,1999)。研究表明,自然状态下,大部分母牛(70%)在一个发情周期中有 2 个卵泡发育波,分别从发情周期第 2 天和第 9~10 天开始,约有 30%母牛在一个发情周期有 3个卵泡发育波,分别从发情周期第 2 天、8~9 天和 15~16 天开始(张运海, 2000;Boer,etal.,2011;Jaiswal,et al.,2009)(图 1-4 和图 1-5)。一般情况下,具有 2 个卵泡发育波母牛的发情周期时间为 19~20 天,而具有 3 个卵泡发育波母牛的发情周期时间稍长,为 22~23 天(Adams,et al.,1999),因此,发情周期天数≤21 天的大多数母牛(88%以上)具有 2个卵泡发育波,而发情周期天数≥22 天的大多数母牛(78%以上)具有 3 个卵泡发育波(Jaiswal,et al.2009)。
  
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  1 卵泡发育与超数排卵

  
  1.1 发情周期卵泡发育
  1.2 卵泡发育的激素调节
  1.3 超数排卵
  
  2 影响牛超数排卵效果的因素
  
  2.1 外源生殖激素的影响
  2.1.1 促性腺激素的影响
  2.1.2 前列腺素的影响
  2.1.3 雌激素的影响
  2.1.4 其他激素的影响
  2.2 供体牛的影响
  2.2.1 牛种的影响
  2.2.2 生产性能的影响
  2.2.3 年龄的影响
  2.2.4 发情周期阶段的影响
  2.2.5 卵巢状态的影响
  2.3 营养和环境的影响
  2.3.1 营养水平的影响
  2.3.2 体况的影响
  2.3.3 环境因素的影响
  2.3.4 疾病的影响
  2.3.5 饲养管理方式的影响
  2.4 超数排卵处理方法的影响
  2.4.1FSH 注射方法的影响
  2.4.2 同期发情方法的影响
  2.4.3 超数排卵次数的影响
  2.5 操作人员技术水平的影响
  
  3.牛超数排卵技术的研究新进展
  
  3.1 超数排卵方法
  3.1.1 FSH 一次注射
  3.1.2 重组长效 FSH
  3.2供体牛的选择
  3.2.1抗缪勒管素与供体牛选择
  3.2.2其他选择方法
  
  4.结语
  
  第 2 章 优质和牛超数排卵与胚胎生产技术研究
  
  1 试验材料与方法

  
  1.1试验材料
  1.1.1供体选择和饲养
  1.1.2试验药品与试剂
  1.1.3试验器材与用品
  1.2试验方法
  1.2.1 供体同期发情处理
  1.2.1.1 自然发情
  1.2.1.2 前列腺素同期发情
  1.2.1.3 CIDR 同期发情
  1.2.2 供体超数排卵
  1.2.2.1 超排方法 1
  1.2.2.1 超排方法 2
  1.2.3 供体胚胎采集与质量鉴定
  1.2.4 胚胎冷冻
  1.2.4.1 常规冷冻与解冻
  1.2.4.2玻璃化冷冻与解冻
  1.2.5 胚胎二分切割
  1.2.6 统计分析
  
  2 试验结果与分析
  
  2.1和牛胚胎生产
  2.2超排次数对和牛超排效果的影响
  2.3不同供体和牛对超排效果的影响
  2.4 不同剂量 FSH 对和牛超排效果的影响
  2.5不同同期发情方法对和牛超排效果的影响
  
  3 讨论与结论
  
  3.1不同和牛对超数排卵效果的影响
  3.2 不同 FSH 剂量对和牛超数排卵效果的影响
  3.3 不同同期发情方法对和牛超数排卵效果的影响
  
  第 3 章 优质和牛胚胎移植试验
  
  1 试验材料与方法

  
  1.1 试验材料
  1.1.1 受体选择与饲养
  1.1.2 试验药品与试剂
  1.1.3 试验器械与用品
  1.2 试验方法
  1.2.1 受体同期发情处理
  1.2.1.1 自然发情
  1.2.1.2 前列腺素同期发情
  1.2.1.3 CIDR 同期发情
  1.2.2 冷冻胚胎解冻与装管
  1.2.3 胚胎切割
  1.2.4 胚胎移植
  1.2.5 受体母牛妊娠检查
  
  2 试验结果与分析
  
  2.1 和牛胚胎移植
  2.2 不同胚胎发育阶段对胚胎移植妊娠率的影响
  2.3 双胚(半胚)对胚胎移植妊娠率的影响
  2.4 不同同期发情方法对胚胎移植妊娠率的影响
  2.5 不同冷冻方法对胚胎移植妊娠率的影响
  
  3 讨论与结论
  
  3.1 受体牛对胚胎移植妊娠率的因素
  3.2 不同胚胎发育阶段对胚胎移植妊娠率的影响
  3.3 新鲜胚胎和冷冻胚胎对移植妊娠率的影响
  3.4 不同同期发情方法对胚胎移植妊娠率的影
  3.5 双胚(半胚)对胚胎移植妊娠率的影响
 
  第 4 章 全文结论

  1.初步建立了和牛超数排卵生产体内胚胎的有效方法。青年供体和牛的最佳超排剂量FSH 为 200~220mg,经产供体和牛的最佳超排剂量 FSH 为 220~240mg。

  2.初步建立了和牛胚胎移植有效方法。胚胎移植妊娠率为 40.50%-43.23%。

  3.初步建立了和牛胚胎双胎移植方法。胚胎移植双胎率为 29.4%。

  参考文献

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