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虾青素脂质纳米囊的生产及其功能研究

发布时间:2019-05-10

摘 要

  虾青素和神经鞘脂类是非常有效的抗氧化、抗衰老成分,能够的延缓皮肤的衰老。

  但是,其水溶性差、见光易分解以及生物利用度低等缺陷限制了它们的应用。因此本文利用微纳米载体技术对虾青素和神经鞘脂类进行处理,并选择了天然来源的磷脂作为乳化剂,从而改善了两种抗衰老成分的应用问题,为更好的应用于化妆品领域提供了参考。

  采用高压均质法制备了虾青素脂质纳米囊(ASX-LNC),并通过单因素法优化了配方和制备工艺。之后对 ASX-LNC 的粒径分布、包封率、微观形貌、红外光谱进行了考察。结果显示,优化后的 ASX-LNC 的平均粒径为 98.1 ± 1.5 nm,多分散指数(PDI)为0.09 ± 0.01。ASX-LNC 中虾青素的包封率可达到 90%以上。透射电镜结果显示,ASX-LNC 为较为规则的球形结构,且无聚集现象。ASX-LNC 的红外光谱结果表明了虾青素被较好的包裹于脂质纳米囊中。

  在此基础上又对 ASX-LNC 进行了稳定性考察和体外评价。物理稳定性以粒径和PDI 为指标,考察了 ASX-LNC 在不同条件下的稳定性,结果证明了 ASX-LNC 具有较好的物理稳定性。化学稳定性则考察了在光照和高温条件下,脂质纳米囊中虾青素含量的变化,结果表明由脂质纳米囊包裹后,虾青素的稳定性得到了较好的改善。经皮行为研究表明,虾青素脂质纳米囊可以改变皮肤角质层的紧密有序的结构,促进虾青素的渗透吸收,提高虾青素在皮肤中的滞留量。体外抗氧化实验结果显示,包裹后的虾青素的抗氧化功效基本没有受到影响。细胞毒性和皮肤刺激性实验证明了所制备的 ASX-LNC在一定浓度下具有较好的安全性,且对皮肤无明显刺激性现象产生。

  采用高压均质法制备了二氢神经鞘氨醇脂质纳米囊(SPG-LNC),并对其粒径分布、微观形貌、红外光谱、稳定性、闭合效应、细胞毒性、皮肤刺激性等进行了研究。测得SPG-LNC 的平均粒径为 161.5 ± 3.4 nm,PDI 为 0.27 ± 0.02,且具有较好的稳定性。红外光谱表明,二氢神经鞘氨醇被较好的包裹在脂质纳米囊中。闭合效应实验说明了SPG-LNC 具有较好的成膜能力和保湿效果。另外,细胞毒性证明了制备的 SPG-LNC 在一定范围内具有较好的安全性,皮肤刺激性研究表明,SPG-LNC 对皮肤基本无刺激性。

虾青素脂质纳米囊的生产及其功能研究

  最后,本文将虾青素脂质纳米囊载体添加到了护肤品中,结果发现,ASX-LNC 添加的护肤品后,其光稳定性和热稳定性有略微的下降。释放研究表明,添加到护肤品后,其中的活性成分依然能够较好的释放。抗氧化实验结果显示,与未添加 ASX-LNC 的护肤品相比,添加 ASX-LNC 的护肤品表现出明显的抗氧化特性,说明了本文开发的抗衰老脂质纳米囊能够较好应用于护肤品中。

  关键词:虾青素;二氢神经鞘氨醇;抗衰老;脂质纳米囊;体外评价

Abstract

  Astaxanthin and sphingolipid are effective antioxidant and anti-aging ingredients. However,the application of them is often limited owing to their high melting point, poor water soluble,bad stability and low bioavailability. So, the technology of nano carrier was used in this paper to solve these problems of the two kinds of active ingredients. Besides, the natural source of lecithin was selected as the emulsifier, which not only plays the role of protective agent, but also acts as a nutritional enhancer.

  The astaxanthin lipid nanocapsules (ASX-LNC) were prepared by high pressure homogenization. The formulation and process were optimized by the single factor experiment.

  The average particle size, encapsulation efficiency, morphology and infrared spectrum of ASX-LNC were investigated. The results showed that the average particle size and PDI of optimized ASX-LNC was 98.1 ± 1.5 nm and 0.09 ± 0.01 respectively. The encapsulation efficiency of astaxanthin was more than 90%. The result of transmission electron microscopy showed that the shape of ASX-LNC was regular and spherical, and the distribution was uniform. The infrared spectra proved that the astaxanthin was encapsulated in lipid nanocapsules better.

  On this basis, the stability and in vitro evaluation of ASX-LNC were carried out. The physical stability was investigated by change of particle size and PDI under different conditions. The results showed that ASX-LNC has good physical stability. The chemical stability of ASX-LNC was investigated under light and high temperature. The results showed that the stability of astaxanthin was improved after being encapsulated in lipid nanocapsules.

  Percutaneous behavior studies showed that ASX-LNC could change the tight structure of the corneum and promote the osmotic absorption of astaxanthin, and increase the retention of astaxanthin in skin. Antioxidant experiments showed that the antioxidant activity of astaxanthin was not affected after being encapsulated. The cytotoxicity and skin irritation test showed thatASX-LNC was safe and had no irritation to the skin.

  The sphingosine lipid nanocapsules (SPG-LNC) were also prepared by high-pressure homogenization. Their micromorphology, infrared spectrum, stability, closure effect, cytotoxicity and skin irritation were studied. The particle size and PDI of SPG-LNC was 161.5 ± 3.4 nm and 0.27 ± 0.02 respectively, and had good physical stability. The results of infrared spectra showed that the sphingosine was encapsulated in this system. The test of closure effect suggested that SPG-LNC had good moisturizing activity. In addition, the cytotoxicity showed that the SPG-LNC has good safety in a certain range.

  Finally, the ASX-LNC was added in skin care products. The results showed that after being added in the products, the light and thermal stability was slightly decreased, and the the active ingredients could still be released. The antioxidant test showed that compared to the products without ASX-LNC, the products added ASX-LNC showed obvious antioxidant activity. These results also proved that the anti-aging lipid nanocapsules could be applied in the field of cosmetics well.

  Key words: Astaxanthin; Sphingosine;Anti-aging; Lipid nanocapsules; In vitro evaluation

目 录

  摘 要
  Abstract

第一章、绪论

  1.1、引言

  衰老问题一直是人类关注的焦点问题,因为对于每个人来说衰老都是无法避免的,其中表现最直接的就是皮肤的衰老了。引起皮肤衰老的因素主要有两种,生理老化和光老化。生理老化表现为随着皮肤细胞的自然衰老,代谢减慢,皮肤脂质合成下降,细胞间质减少,水分流失,皮肤出现干燥,色斑以及皱纹等现象[1, 2]。光老化主要是环境(外部因素)对皮肤的影响,包括紫外光照射,污染日益严重的环境以及不良的生活习惯等,这些因素会导致机体产生过量的自由基而无法及时清除,造成皮肤细胞和胶原质的损伤和破坏。近年来,科学技术的快速发展加快了功能性化妆品前进的步伐,从 20 世纪末开始,以抗衰老为主导的美容科技领域变得炙手可热,抗衰老化妆品也越来越受到人们的青睐。在此背景下,本文分别研究了负载虾青素(Astaxanthin,ASX)和二氢神经鞘氨醇(Sphingosine, SPG)两种活性成分的抗衰老脂质纳米囊,并将其添加在护肤品中,为后续的应用提供参考。

  1.2、抗衰老成分

  1.2.1、虾青素

  1.2.1.1、虾青素的结构和来源

  虾青素(Astaxanthin)是在自然界广泛存在的一种抗氧化剂,其化学名称为 3,3’-二羟基-4,4’-二酮基-β-胡萝卜素,分子式为 C40H52O4,化学结构如图 1-1 所示。虾青素作为一种脂溶性类胡萝卜素,在水中的溶解度极低,但易溶于氯仿,苯,吡啶,石油醚等有机溶剂。虾青素在自然界中主要由水生浮游植物和微藻类产生,如红发夫酵母、雨生红球藻等。由于人体自身不能合成虾青素,所以只能通过食物链从水生动物或藻类中获取。虾青素在生物体内可以与蛋白质结合,形成为青色或者蓝色物质,而经过高温加热后,虾青素可以恢复单体形式变为红色,这就是大多数甲壳类生物在烹调过程中由青色变为红色的原因。目前,虾青素常作为颜料着色剂,饲料添加剂以及营养保健品[3],在医疗,美容,保健食品等行业中应用广泛。

图 1-1 虾青素的结构式
图 1-1 虾青素的结构式

  目前,虾青素的生产方法主要有两种,人工合成法和天然提取法。虾青素是类胡萝卜素合成的最终产物,人工合成十分困难。人工合成的虾青素成本较高,而且在结构、功能、应用及安全性等方面都有不足,与天然提取的虾青素有着明显的差别。目前,按照提取的原材料不同,天然提取法大致可分为三种类型[4]。一是从水产品的加工废料中提取,该方法通常是先将废料进行粉碎,然后酸解,再用石油醚、二氯甲烷丙酮等有机溶剂进行提取得到。第二种所用的原材料为酵母菌落,经发酵生产虾青素,其中以红发夫酵母(Phaffia rhodozyma)菌落最为常用,天然的红发夫酵母中虾青素平均含童为0.40%,是虾青素较好的生物来源。三是从藻类中提取,雨生红球藻是自然界中已发现的虾青素含量最为丰富的生物,虾青素及其脂类含量(干重)最高达 8.0%左右,常被看作是天然虾青素的“浓缩品”,本文选用的虾青素油就是从雨生红球藻中提取的虾青素产品,其中虾青素的含量可达 10%。

  1.2.1.2、虾青素的主要功能

  虾青素是目前发现的抗氧化能力最强的天然抗氧化剂,它本身具有特殊的结构,每个虾青素分子具有两个紫罗兰酮环,环上的羟基和酮基团在保护细胞膜时都要经过细胞膜,这使得虾青素分子可以贯穿整个细胞膜结构,而其他的抗氧化剂则没有这种特性。有研究表明,虾青素的抗氧化能力明显高于其他抗氧化剂[5],虾青素的抗氧化能力是维生素 E 的 1000 倍,是 β-胡萝卜素的 10 倍。

  近年来,虾青素的抗衰老作用被越来越多的研究人员所关注,虾青素的抗衰老性能表现在其抗氧化、抗紫外线、抗皱纹的作用上,保护皮肤细胞免于紫外线等不利因素导致的损伤。众所周知,紫外线是引起人体皮肤衰老的一个重要的外界因素,暴露在紫外线中会增加机体自由基的产生,而自由基会引起细胞的 DNA 损伤,蛋白质降解和脂质氧化,导致皮肤细胞的损伤和衰老。雨生红球藻自身可以代谢产生虾青素[7, 8],从而保护其细胞免受紫外线照射带来的损伤。在人体中,虾青素对紫外光同样具有抵抗作用,防止紫外线照射导致的皮肤老化,进而有效的缓解皮肤的皱纹,延缓皮肤的衰老[9]。虾青素参与抑制皮肤老化的过程如下:当皮肤暴露在阳光下时,太阳光中的紫外线穿透皮肤表层[10],到达真皮层,促进机体产生氧自由基,氧自由基可以激活基质金属蛋白酶(MMPs),而这种酶能够降解基质蛋白,如皮肤真皮层中的胶原蛋白和弹力纤维,这两种物质洽洽可以保持皮肤的强度和弹性。Fischer 等人研究[11]

  发现,当人的皮肤暴露于紫外线时,会大大增加真皮层中胶原蛋白的降解,并可能有助于 MMPs 活性的增强,增加皮肤的光老化过程。而虾青素可以减少这些氧化水平[12],通过清除氧自由基去除活化的MMPs,防止胶原蛋白降解,从而保护皮肤,抑制衰老。Tominaga 等人[13]曾报道,虾青素清除氧自由基的能力比其他抗氧化剂要强得多,并在研究虾青素减少皮肤皱纹机制的过程中发现,虾青素修复单线氧诱导的人体成纤维细胞损伤的能力远远大于儿茶素、维生素 C、维生素 E、辅酶 Q10、α-硫辛酸等抗氧化剂,该研究还表明,直接在皮肤应用可能比口服使用更能深入地改善粗糙的皮肤,延缓皮肤的衰老。此外,由于具有清除自由基的能力,虾青素还是潜在的治疗如心血管疾病,糖尿病,胃病等病症的药物[14, 15],而且能够缓解眼疲劳,增加肌肉的耐力,提高人体自身的免疫力[16, 17]。

  1.2.1.3、虾青素的研究进展

  然而,由于虾青素不溶于水,生物利用度低,并且其双键结构对氧和热高度敏感(即使在室温条件下也极易被氧化),所以难以储存和使用[18]。因此研究人员在提高虾青素的稳定性和水溶性等方面,进行了大量的实验和研究。近年来,一些研究者已经发现,利用药物传递系统可以提高虾青素的溶解性能和生物利用度,包括从简单的油脂分散体系到以纳米技术为导向的载体系统。例如将其负载在微胶囊、包合物、聚合物纳米粒、纳米结构脂质载体等微纳米载体中,用以改善虾青素本身的缺点,达到应用的目的。

  Shen[19]等人将虾青素与酪蛋白和可溶性谷物纤维混合制备乳液,并通过喷雾干燥的方式将其粉末化,制备了负载虾青素的微胶囊,提高了虾青素的稳定性。Tamjidi[20]等人以吐温 80 和磷脂作为表面活性剂,制备了负载虾青素的纳米结构脂质载体,从而提高了虾青素的稳定性和生物利用度,但是虾青素的负载量仅仅只有 0.04%。Yuan[21]等人通过真空干燥的方法制备了负载虾青素的羟丙基-β-环糊精包合物,并考察了其在 28 天内的稳定性,结果表明在 28 天后,羟丙基-β-环糊精包合物中的虾青素含量仅下降了 7.20%,有效的改善了虾青素的稳定性,但该方法需要用到大量的有机溶剂,且制备方法不利于大规模的工业生产。

  以上研究虽然通过微纳米载体技术包裹了虾青素,但是由于有机溶剂的使用,其安全性仍然值得探讨,同时所制备载体的负载量较低,一般都不到 1%,稳定性也有待于进一步的提高,所以如何规模生产稳定、易吸收和高含量的虾青素载体,仍是亟需解决的问题。因此本文致力于研究通过相对安全的方法制备性能优良、含量较高的水溶性的虾青素纳米载体。

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      1.2.2 神经鞘脂类
    1.3 微纳米载体技术
      1.3.1 脂质纳米囊的定义
      1.3.2 脂质纳米囊的制备方法
      1.3.3 脂质纳米囊的研究现状
    1.4 研究目的和内容
      1.4.1 研究目的
      1.4.2 研究内容
  第二章 虾青素脂质纳米囊的制备和表征
    2.1 实验试剂与仪器
      2.1.1 实验试剂
    2.2 实验方法
      2.2.1 虾青素检测方法
      2.2.2 乳化剂和助溶剂的筛选
      2.2.3 甘油用量的考察
      2.2.4 均质压力的研究
      2.2.5 均质次数的优化
      2.2.6 高压均质技术
      2.2.7 酸碱度测定
      2.2.8 粒径、PDI 及 Zeta 电位测定
      2.2.9 含量测定
      2.2.10 包封率测定
      2.2.11 可重复性考察
      2.2.12 形貌观测(TEM
      2.2.13 红外光谱分析
    2.3 结果与讨论
      2.3.1 虾青素检测方法
      2.3.2 乳化剂的筛选
      2.3.3 助溶剂的选择
      2.3.4 甘油用量的考察
      2.3.5 均质压力的研究
      2.3.6 均质次数的优化
      2.3.7 酸碱度测定
      2.3.8 粒径、PDI 及 Zeta 电位测定
      2.3.9 含量及包封率测定
      2.3.10 可重复性考察
      2.3.11 形貌观测(TEM
      2.3.12 红外光谱分析
    2.4 本章小结
  第三章 虾青素脂质纳米囊的稳定性考察及体外评价
    3.1 实验试剂与仪器
      3.1.1 实验试剂
      3.1.2 实验仪器
    3.2 实验方法
      3.2.1 物理稳定性考察
      3.2.2 化学稳定性
      3.2.3 释放研究
      3.2.4 经皮行为研究
      3.2.5 抗氧化活性研究
      3.2.6 细胞评价
      3.2.7 皮肤刺激性研究
    3.3 结果与讨论
      3.3.1 物理稳定性考察
      3.3.2 化学稳定性
      3.3.3 释放研究
      3.3.4 经皮行为研究
      3.3.5 抗氧化活性研究
      3.3.6 细胞评价
      3.3.7 皮肤刺激性研究
    3.4 本章小结
  第四章 二氢神经鞘氨醇脂质纳米囊的制备和评价
    4.1 实验试剂与仪器
      4.1.1 实验试剂
      4.1.2 实验仪器
    4.2 实验方法
      4.2.1 脂质的确定
      4.2.2 乳化剂和助溶剂的筛选
      4.2.3 甘油用量的考察
      4.2.4 均质压力和次数的研究
      4.2.5 制备流程及方法
      4.2.6 酸碱度测定
      4.2.7 粒径、PDI 及 Zeta 电位测定
      4.2.8 形貌观测(TEM
      4.2.9 红外光谱分析
      4.2.10 稳定性考察
      4.2.11 闭合效应
      4.2.12 细胞毒性评价
      4.2.13 皮肤刺激性研究
    4.3 结果与讨论
      4.3.1 脂质的确定
      4.3.2 乳化剂和助溶剂的筛选
      4.3.3 甘油用量的考察
      4.3.4 均质压力的研究
      4.3.5 均质次数的优化
      4.3.6 酸碱度测定
      4.3.7 粒径、PDI 及 Zeta 电位的测定
      4.3.8 可重复性考察
      4.3.9 形貌观测(TEM
      4.3.10 红外光谱分析
      4.3.11 稳定性考察
      4.3.12 闭合效应
      4.3.13 细胞毒性评价
      4.3.14 皮肤刺激性研究
    4.4 本章小结
  第五章 抗衰老脂质纳米囊在化妆品中的应用
    5.1 实验试剂与仪器
      5.1.1 实验试剂
      5.1.2 实验仪器
    5.2 实验方法
      5.2.1 稳定性考察
      5.2.2 释放研究
      5.2.3 经皮行为研究
      5.2.4 抗氧化活性研究
    5.3 实验结果
      5.3.1 稳定性考察
      5.3.2 释放研究
      5.3.3 经皮行为研究
      5.3.4 抗氧化活性研究
    5.4 本章小结

第六章 总结与展望

  虾青素作为自然界中最强的天然抗氧化剂,不仅能够中和自由基,还能保护皮肤免受紫外线损伤,减少皱纹,延缓皮肤衰老,无论是在药品、食品还是日用化妆品领域,均有极高的应用价值。但由于虾青素不溶于水、氧化稳定性差,需要对其进行微纳米包裹,从而提高虾青素的水溶性,改善其稳定性,实现应用的目的。

  神经鞘脂类作为人体皮肤脂质的主要组成部分,与其他脂质一起构成了人体与外界环境的保护屏障,具有保持水分、抵抗外界刺激以及抗皱防衰老等多重护肤功效。但是神经鞘脂类的水溶性较差,且易结晶析出,极大地限制了它们的应用。本文分别制备和评价了负载虾青素和二氢神经鞘氨醇的脂质纳米囊,以提高两种抗衰老成分的水溶性、稳定性和生物利用度,而且将虾青素脂质纳米囊添加到了化妆品中,并进行了相关的考察,为虾青素和二氢神经鞘氨醇在化妆品领域的应用提供了新的思路。

  6.1、主要结论

  本论文的主要结论分以下四部分阐述:

  (1)使用高压均质法成功制备出了虾青素脂质纳米囊(ASX-LNC)。在乳化实验的基础上,以平均粒径、多分散指数(PDI)以及 Zeta 电位作为评价指标,得到了虾青素脂质纳米囊的最佳配方。确定甘油与去离子水的比例为 4:1;磷脂种类为 PC60,含量为 5%;同时,确定了最优的高压均质工艺为 800 bar 下进行 4 个循环。优化后的虾青素脂质纳米囊的平均粒径为 98.5 ± 1.5 nm,PDI 为 0.09 ± 0.01,Zeta 电位为-30.2 ± 0.2 mV。

  可重复性实验表明所确定的配方及工艺具有较好的可重复性。透射电镜结果表明虾青素脂质纳米囊为较为规则的球形结构,且无聚集现象。红外光谱证明了虾青素被较好的包裹于脂质纳米囊中。

  (2)对虾青素脂质纳米囊样品进行了稳定性考察,结果显示该脂质纳米囊具有较好的离心、稀释以及冻融稳定性,长期存储稳定性研究表明虾青素脂质纳米囊更适合储存在低温和避光条件下,且经过包裹后的虾青素的稳定性得到了明显提高。释放研究结果表明,相比于虾青素乙醇溶液,被包裹后的虾青素的释放时间延长,说明载体中的虾青素具有一定的缓释效果。经皮行为研究则表明,脂质纳米囊可以促进虾青素的皮肤渗透,增大其在皮肤中的滞留量。体外抗氧化实验结果显示虾青素被脂质纳米囊包裹后仍然能够较好地发挥抗氧化功效。细胞毒性结果显示虾青素脂质纳米囊的浓度为 0.32 ~5.00 mg/mL 时,对细胞生长基本无影响,应用比较安全,浓度增加时毒性逐渐增大,存在一定的安全隐患。一次和多次皮肤刺激性实验证明了样品涂抹于大鼠正常皮肤后不会产生红斑以及水肿现象,对皮肤基本无刺激性。

  (3)通过高压均质技术制备二氢神经鞘氨醇脂质纳米囊(SPG-LNC),并对二氢神经鞘氨醇脂质纳米囊进行了理化表征以及体外评价。由马尔文粒度仪测得其平均粒径为161.5 ± 3.4 nm,PDI 为 0.27 ± 0.02,Zeta 电位为 45.8 ± 0.4 mV。傅里叶红外光谱图结果证明了二氢神经鞘氨醇得到了较好的包裹。闭合效应实验结果表明,二氢神经鞘氨醇脂质纳米囊具有较好的成膜能力,从而提高产品的保湿性能。细胞毒性结果证明了在考察的浓度范围内,二氢神经鞘氨醇脂质纳米囊的浓度为 0.06 ~ 0.50 mg/mL 时应用比较安全,不会对皮肤细胞造成损伤。皮肤刺激性实验表明该脂质纳米囊对皮肤基本无刺激性。

  (4)本章将抗衰老脂质纳米囊添加到护肤品中,并对其稳定性和功效进行了评价。结果表明,添加到护肤品后,虾青素脂质纳米囊的光稳定性和热稳定性均有所下降。但在避光和 4 °C 条件下依然表现出较好的稳定性,在此条件下放置四周后,虾青素的保留率依然可以达到 90%左右。另外,对该护肤品的释放行为,经皮行为以及抗氧化活性进行了评价。释放行为表明,加入到护肤品后,虾青素脂质纳米囊依然能够较好地释放。

  经皮行为实验表明,加入到护肤品后,虾青素的皮肤渗透量有所降低。抗氧化活性实验证明了添加到化妆品后,虾青素脂质纳米囊依然能够较好的发挥其抗氧化功效。

  6.2、工作展望

  本文分别研究了负载虾青素和二氢神经鞘氨醇的脂质纳米囊,为解决该类脂溶性抗衰老成分的应用瓶颈提供了思路,有助于它们在化妆品领域的应用,但仍然存在一些不足,需要进一步考察和研究:

  (1)毒理学研究。本课题只对脂质纳米囊的皮肤刺激性实验进行了考察,未深入研究样品毒理学评价。化妆品在正常使用条件下不得对人体产生危害,因此,需要进一步研究样品的急性经口、急性经皮毒性实验以及慢性毒性和皮肤变态反应等毒理学检测。

  (1)人体安全性评价。化妆品毒理学检测结果合格后需要进行人体安全性评价,主要包括人体皮肤斑贴试验和人体试验安全性评价。

  (3)中试生产及量产工艺优化。在产品投入市场之前一般会进行中试生产,而在放大实验时,是否能够顺利生产,体系的稳定性是否发生变化,需要进一步试验和优化。

  参考文献
  致谢

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